专家指南：miRNA分析中的qRT-PCR疑难解答（上）[心得点评]

在miRNA分析中，实时定量PCR是一个有力的工具。不过对于具体的问题，例如怎么设计引物，如何确定Ct值，如何区分前体和成熟的miRNA，你可能还是有一堆问号。那就进来看看吧，专家为你答疑解惑。

实践出真知。我们的实验中往往会遇到一些很细节的问题，但在普通的教科书上又找不到现成的答案。怎么办？寻找身边的实验达人。可是在miRNA这个相对较新的领域，达人还不太多。生物通就帮大家找了一班实验达人，就miRNA分析中的qRT-PCR检测的6个热门问题，谈谈自己的经验。希望大家可以从中受到一点启发。

Q1：如何为miRNA设计引物？利用茎环结构还是引物延伸？
Q2：如何确定Ct值？理想的Ct值是多少？
Q3：如何检测miRNA？使用SYBR green吗？
Q4：你如何确定检测效率？怎样称之为好的效率？
Q5：如何区分前体和成熟的miRNA？
Q6：还需要其他的定量分析来进行补充吗？

Q1：如何为miRNA设计引物？利用茎环结构还是引物延伸？

John Rasko & Stephane Flamant 美国centenary大学的基因和干细胞治疗计划
我们的方法是基于经典的小分子RNA克隆。从总RNA入手，在microRNA的3’端加上一个接头。然后利用接头特异的引物来进行反转录（引物延伸法）。接着还是利用同样的引物，连同5’microRNA特异的引物，来进行定量PCR反应。由于microRNA的确很小，引物的选择余地也不大。我们通常设计的引物覆盖最初15-17个核苷酸，留下最后6个核苷酸用于测序验证。

Thomas Schmittgen 俄亥俄州立大学副教授
我们只利用ABI的TagMan assay（茎环结构）来检测成熟的microRNA。这些assays是预先设计并验证过的。

Frank Slack, Phong Trang, & Joanna Weidhaas 耶鲁大学医学院
我们应用的是TaqMan assays。由于micoRNA很短，采取茎环结构的引物会更好。

M.azim Surani & Fuchou Tang 剑桥大学Gurdon Institute
我们也是应用茎环结构的引物来定量microRNA。对于每一个microRNA，我们设计了三条引物：一条反向引物用于反转录，一条正向引物，还有一条通用的反向引物，同时用于pre-PCR扩增步骤和实时定量PCR步骤。特异的反向引物约42-44个核苷酸，其5’端的36个核苷酸序列是固定的，形成一个8核苷酸环和20核苷酸茎的结构，其3’端的6-8个核苷酸就与microRNA互补。正向引物长约25-32个核苷酸，在3’端有11-18个核苷酸与相应的microRNA互补，而剩余14个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。通用的反向引物为23nt，其中18个核苷酸对应特异反向引物的茎环结构部分，而5’端的5个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。

Wei Yan 美国内华达州大学医学院
我们的microRNA PCR方法是将小分子RNA的cDNA（srcDNA）作为模板。srcDNA由microRNA聚腺苷酸后，用RTQ引物反转录产生。RTQ引物在5’端包含一个100bp的接头序列，然后是25 oligo dT，以及两个简并核苷酸V（A、G或C）和N（A、G、C和T）。特定microRNA产生的srcDNA水平可由PCR进行分析，用microRNA特定的引物作为正向引物，对应srcDNA3’端接头序列的通用引物作为反向引物。整个microRNA序列除了最后的2个核苷酸都可以用作正向引物，而反向引物可以根据Tm值和GC含量从接头序列中选择。

Q2：如何确定Ct值？理想的Ct值是多少？

John Rasko & Stephane Flamant
循环阈值是由扩增指数期的中部来决定的，大约是在25-35个循环之间，取决于样品和目的microRNA。每一个反应进行三次，同时还有一个阴性的反转录对照。对于每一个检测的样品，我们都用广泛表达的microRNA，如let-7a或miR-21，作为阳性内参。

Thomas Schmittgen
我们应用的是ABI 7900定量PCR仪。通常我们利用软件的默认参数来计算Ct值。对于成熟的microRNA来说，Ct值在20多是正常的（一般在25到30之间）。许多人认为Ct值高于35就代表背景或干扰。我们使用TaqMan探针，它背景很低，因此我们能检测到低水平的microRNA。另一个方法是将实时定量PCR的数据表示为“每个细胞中microRNA的拷贝数”。这在2005年《Nucleic Acids Research》杂志上Caifu Chen的文章中描述过。其中有一些假设，不过它对细胞中microRNA的拷贝数进行了很好的评估。它还有助于了解背景问题。一般说来，每个细胞中microRNA的拷贝数为10或以下就可以认为是背景。

Frank Slack, Phong Trang, & Joanna Weidhaas
我们通常让ABI TaqMan程序来选择循环阈值。如果我们需要手工设定，我想需要依赖阳性和阴性对照。

M.azim Surani & Fuchou Tang
我们通常将表达谱研究中的检测阈值设为恒定的0.2。对于pre-PCR 18个循环扩增的cDNA样品来说，理想的Ct值在10-28之间。如果Ct值大于32，表示cDNA模板的拷贝数很低。一般说来，Ct值大于28时标准偏差相对很大。

Wei Yan
我们利用SYBR green和ABI的7300定量PCR仪进行microRNA定量分析。Ct值是指荧光信号到达阈值水平时的循环数。将阈值水平设定为0.1-0.3时，每个microRNA样品的Ct值可以自动计算。所有的Ct值都取决于目标microRNA的丰度。例如，当使用25ng scrDNA时，let-7的平均Ct值介于17-20之间。

Q3：如何检测miRNA？使用SYBR green吗？

John Rasko & Stephane Flamant
我们是通过TaqMan探针来检测microRNA的。

Thomas Schmittgen
我们利用TaqMan探针来检测成熟的microRNA。对于microRNA前体，我们用SYBR green或TaqMan探针。

Frank Slack, Phong Trang, & Joanna Weidhaas
我们用的是ABI的TaqMan探针，因为它比SYBR green特异性更好。但是也要贵一些。

M.azim Surani & Fuchou Tang
我们用TaqMan探针来检测microRNA的表达。对于多重microRNA分析来说，使用SYBR green降低特异性，并降低了检测的灵敏度，因为在pre-PCR扩增反应中，可能出现引物二聚体。

Wei Yan
对于定量PCR分析，我们利用SYBR green方法，因为它便宜一些，而且准确度和重复性与探针方法差不多。

待续……

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